di Constantinos C Mylonas, Coordinatore del progetto (HCMR, Gree), Brigida Norberg, Riproduzione e genetica - Atlantic Halibut Leader (IMR, Norvegia), Kristin Hamre, Nutrizione - Leader Halibut Atlantico (NIFES/IMR, Norvegia), Torstein Harboe, Allevamento di larve - Leader dell'halibut atlantico (IMR, Norvegia), Sonal Patel, Salute dei pesci - Leader dell'halibut atlantico (IMR, Norvegia; attualmente in VAXXINOVA, Norvegia) e Rocio Robles, Responsabile della diffusione (CTAQUA, Spagna)

Una delle specie incluse nel progetto DIVERSIFY finanziato dall'UE, che correva tra il 2013 e il 2018 era l'ippoglosso atlantico (Hippoglossus hippoglossus). L'ippoglosso atlantico è il pesce piatto più grande del mondo e può raggiungere un peso di oltre 300 kg. È molto apprezzato nei mercati di tutto il mondo, ma la disponibilità di halibut atlantico selvatico sta diminuendo.

Le azioni norvegesi sono classificate come vitali, ma la pesca è soggetta a una regolamentazione rigorosa. Ciò ha portato a una maggiore domanda di mercato per l'ippoglosso atlantico, che non possono essere soddisfatte dalla sola pesca.

L'ippoglosso atlantico (vedi figura 1) è un pesce semigrasso, ricco di acidi grassi omega-3, con una caratteristica carne bianca a scaglie con poche ossa. L'ippoglosso atlantico coltivato ha un'eccellente reputazione ed è tradizionalmente commercializzato come grandi bistecche o cotolette di pesce. Può essere affumicato o marinato nel tipico stile scandinavo. Queste caratteristiche hanno portato all'inclusione dell'ippoglosso atlantico in DIVERSIFY, come un ottimo candidato per le specie ittiche e la diversificazione dei prodotti nell'acquacoltura europea.

Gli sforzi di ricerca e coltivazione dell'ippoglosso atlantico sono iniziati negli anni '80, e sebbene la produzione annuale totale di halibut atlantico coltivato sia in aumento, ha raggiunto ancora solo circa 1600 tonnellate nel 2017 (Direzione norvegese della pesca).

In Europa, Esistono allevamenti di ippoglosso nero in Norvegia e Scozia. La dimensione del mercato desiderata è di 5-10 kg e il tempo di produzione è attualmente di quattro-cinque anni. Nonostante un notevole sforzo di ricerca tra il 1985 e il 2000, il complicato ciclo di vita dell'ippoglosso atlantico ha rallentato i progressi dell'acquacoltura, e in seguito sono stati stanziati pochissimi fondi per la ricerca.

Però, durante questo periodo gli agricoltori hanno compiuto progressi lenti ma costanti al fine di migliorare la stabilità della produzione, e l'interesse per la cultura sia in gabbia che a terra sta crescendo. I restanti colli di bottiglia per una produzione maggiore e stabile sono legati a una fornitura costante di avannotti e alla necessità di ridurre i tempi di produzione.

Quest'ultimo può essere raggiunto con la recente istituzione di una produzione giovanile "tutta al femminile". Si prevede che ciò avrà un impatto importante sui tempi di produzione poiché le femmine crescono più velocemente e maturano più tardi:l'80% dei pesci macellati <5 kg sono maschi maturi.

Il progetto DIVERSIFY ha affrontato questi importanti colli di bottiglia con uno sforzo di ricerca coordinato sulla riproduzione, nutrizione e allevamento delle larve e sviluppo di vaccini. La combinazione di biologico, Le attività di ricerca tecnologica e socioeconomica sviluppate nell'ambito di DIVERSIFY dovrebbero sostenere la diversificazione del settore dell'acquacoltura dell'UE e contribuire all'espansione della produzione, aumento dei prodotti dell'acquacoltura e sviluppo di nuovi mercati.

Riproduzione

La ricerca nel nostro progetto ha confermato che le femmine catturate in natura si sono riprodotte in modo affidabile e hanno prodotto uova costantemente di altissima qualità (>85% di fecondazione). Le femmine allevate producevano anche uova di alta qualità quando venivano identificati i loro cicli ovulatori, e lo stripping è stato effettuato vicino all'ovulazione (vedi figura 2).

Per la produzione commerciale, oltre a scopi riproduttivi, non è pratico fare affidamento su femmine catturate in natura. Però, relativamente poche femmine allevate hanno prodotto uova in modo coerente con tassi di fecondazione>80-85 per cento. Come conseguenza, potrebbe essere necessario includere riproduttori selvatici anche in futuri gruppi di riproduzione per garantire un materiale genetico sufficientemente ampio.

Le concentrazioni plasmatiche di steroidi sessuali negli allevatori d'allevamento erano simili a quanto riportato in precedenza nell'halibut atlantico, con profili annuali a seguito di crescita e maturazione ovarica. I livelli più alti di 17β-estradiolo (E2) sono stati registrati appena prima della deposizione delle uova, all'inizio di febbraio, mentre sia E2 che testosterone (T) sono rimasti elevati durante il periodo di deposizione delle uova.

Non sono state osservate differenze nelle concentrazioni medie tra le femmine catturate in natura e quelle allevate. Le concentrazioni plasmatiche dell'ormone follicolo-stimolante delle gonadotropine (FSH) e dell'ormone luteinizzante (LH) sono state documentate per la prima volta nell'ippoglosso atlantico.

Le concentrazioni medie di FSH erano relativamente stabili durante la vitellogenesi, da ottobre a inizio febbraio, coerente con un rilascio costitutivo di FSH dall'ipofisi. L'FSH plasmatico è diminuito a livelli bassi durante la deposizione delle uova, ma è aumentato nuovamente dopo che la deposizione delle uova è stata completata.

Le concentrazioni plasmatiche di LH hanno mostrato grandi variazioni individuali durante il ciclo riproduttivo, ma durante la deposizione delle uova sono stati rilevati livelli elevati. Ciò era coerente con i risultati precedentemente riportati in altri teleostei, compreso un certo numero di pesci piatti.

L'impianto con agonista dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHa) non ha anticipato significativamente il tempo di deposizione delle uova nelle femmine di ippoglosso atlantico, ma è stata osservata un'apparente sincronizzazione nel tempo di deposizione delle uova tra gli individui, poiché le femmine trattate avevano completato la deposizione delle uova un mese prima che i pesci di controllo fossero spesi. Nella produzione commerciale, la sincronizzazione tra gli individui può essere un vantaggio in quanto gli sforzi del personale nella raccolta delle uova possono essere concentrati su un periodo relativamente breve (vedi figura 3).

Gli allevatori di halibut atlantico devono essere monitorati per l'ovulazione e spogliati regolarmente, e gli ovuli vengono fecondati in vitro. Perciò, l'uso dell'impianto di GnRHa offre un vantaggio logistico alla gestione commerciale dei riproduttori della specie, riducendo la stagione riproduttiva.

Nutrizione

Per lo sviluppo di un protocollo per lo svezzamento precoce delle larve di ippoglosso nero, abbiamo trovato una grande differenza per quanto riguarda l'assunzione di mangime delle larve su tre diverse diete commerciali a 28 giorni dopo la prima alimentazione (dpff) (vedi figura 4).

Le larve alimentate con la dieta larvale marina commerciale Otohime (Giappone) avevano le viscere piene dopo cinque giorni di alimentazione. Questa dieta è stata utilizzata in un esperimento volto a trovare il primo momento dello svezzamento a 15 anni, 22 e 28 dpff. Lo svezzamento a 15 dpff ha provocato quasi il 100% di mortalità, a 22 dpff circa il 30% di mortalità e a 28 dpff, quasi lo zero per cento di mortalità.

La conclusione è stata che le caratteristiche della dieta sono importanti per garantire l'assunzione di mangime nelle larve di ippoglosso nero e che le larve sono pronte per nutrirsi con un mangime formulato solo a 28 dpff. Sono necessari ulteriori esperimenti per valutare se le prime larve crescono e si sviluppano bene con queste diete.

Anche, è stato sviluppato un protocollo per la produzione di Artemia in crescita ed è stata analizzata la composizione dei nutrienti. Artemia coltivata per tre giorni sul terreno di coltura ORI-culture (Skretting, Spagna) e poi arricchito con il medium LARVIVA Multigain (Biomar, Danimarca) ha ottenuto un profilo nutritivo migliorato sotto molti aspetti.

La proteina, contenuto di aminoacidi liberi e taurina aumentato, lipidi e glicogeno diminuiti, mentre il rapporto tra fosfolipidi (PL) e lipidi totali (TL) è aumentato. La composizione in acidi grassi è migliorata in un esperimento, ma non a quello effettuato presso il partner commerciale. I profili dei micronutrienti non sono stati influenzati negativamente dalla coltura di Artemia sul terreno di coltura ORI.

Poiché la ricerca precedente aveva scoperto che le larve alimentate dall'artemia cresciuta si sviluppavano in giovani con una qualità migliore, le larve sono state alimentate con Artemia cresciuta rispetto ai naupli di Artemia convenzionali in DIVERSIFY (vedi figura 5).

Non ci sono state differenze nella crescita, la pigmentazione o migrazione degli occhi tra i due gruppi e la composizione nutritiva delle larve dopo tre settimane di alimentazione era molto simile. La conclusione è stata che i naupli di Artemia prodotti con metodi moderni hanno livelli di nutrienti sufficienti per coprire il fabbisogno delle larve di halibut atlantico.

Anche, l'ipotesi che le larve allevate in sistemi di acquacoltura a ricircolo (RAS) avrebbero un'altra microflora nell'intestino e, perciò, hanno un diverso assorbimento di nutrienti è stato esaminato. Però, ad eccezione di livelli più elevati del derivato della vitamina K MK6, non abbiamo trovato differenze nell'utilizzo dei nutrienti tra le larve allevate in RAS o nei sistemi di flusso.

Finalmente, I giovani di ippoglosso atlantico (peso corporeo di un grammo) sono stati alimentati con diete con cinque livelli di PL che variavano dal 9 al 32% di TL. Non ci sono stati effetti dei livelli di PL sulla crescita o sulla composizione lipidica nell'intestino, fegato e muscoli, 24 ore dopo l'alimentazione.

Però, tempo dopo il pasto ha influenzato la composizione lipidica del tessuto intestinale, con livelli più elevati di lipidi neutri una e quattro ore dopo il pasto, e livelli più elevati di lipidi polari, esteri del colesterolo e ceramide a 24 ore post-prandiali, riflettendo l'assorbimento dei lipidi subito dopo il pasto.

Sembra che i giovani di ippoglosso atlantico regolino la composizione della loro specie lipidica per essere indipendenti dalla dieta quando viene applicata una gamma di PL/Triacyl Glycerol, come nel presente studio (vedi figura 6).

Allevamento di larve

È stato sviluppato e descritto un protocollo per la crescita dei naupli di Artemia. L'uso di Artemia in crescita durante il periodo critico della metamorfosi nelle larve di ippoglosso nero non differiva dall'uso di naupli di Artemia per quanto riguarda la crescita, mortalità e qualità degli avannotti. Inoltre, la produzione di Artemia coltivata era ad alta intensità di lavoro, e gli elevati costi del personale possono essere proibitivi nell'implementazione di questa fonte di mangime vivo nella larvicoltura commerciale.

La produzione commerciale di avannotti di halibut atlantico è attualmente effettuata in sistemi a flusso continuo (FT), mentre c'è un crescente consenso sul fatto che un RAS offrirebbe parametri ambientali e chimici dell'acqua più stabili che porterebbero a migliori prestazioni delle larve.

I protocolli di produzione per il sacco vitellino e la prima alimentazione delle larve in RAS sono stati sviluppati in DIVERSIFY. Non sono state rilevate differenze nella sopravvivenza tra l'allevamento RAS e FT durante l'incubazione del sacco vitellino. Quando i sistemi sono stati innescati per un mese, la crescita larvale era significativamente più alta nel gruppo RAS durante la prima alimentazione. Alta mortalità si è verificata in uno dei serbatoi FT.

Presi insieme, risultati hanno suggerito che con un adeguato condizionamento del RAS, viene stabilito un sistema stabile in cui la crescita e la sopravvivenza delle larve sono buone quanto, o meglio che nei sistemi FT con condizioni ottimali. Il RAS era un sistema di allevamento più stabile per le larve di ippoglosso nero rispetto al sistema FT.

La caratterizzazione metagenomica delle comunità batteriche nell'acqua di allevamento e nelle larve ha rivelato che nei sistemi di allevamento erano presenti almeno 300-400 generi batterici diversi. Sono state rilevate differenze significative nella composizione del micro biota dei sistemi RAS e FT:sia nei silos che nei serbatoi, e nell'acqua e nelle larve.

Non è stata osservata alcuna correlazione evidente tra il micro biota nell'acqua e il micro biota delle larve. La caratterizzazione della composizione del micro biota fornisce importanti informazioni per lo sviluppo del trattamento probiotico delle larve di halibut atlantico.

Salute del pesce

Al fine di sviluppare un vaccino contro la necrosi neurale virale per le larve di ippoglosso nero, la proteina capside di Nodavirus è stata espressa con successo in modo ricombinante in tre diversi sistemi; E. coli, Leishmania tarentolae e nella pianta del tabacco, e come previsto c'era una variazione nella quantità di espressione tra i sistemi.

Inoltre, la proteina del capside ricombinante espressa in Pichia è stata fornita dal progetto UE TARGETFISH. Questi quattro sistemi di espressione differiscono nel modo in cui le proteine ​​espresse sono glicosilate post-traduzionali. Con la costruzione e l'utilizzo di E. coli e Leishmania tarentolea che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP), potrebbe essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza che Artemia ha filtrato in modo efficiente e ha ingerito questi microbi, e quindi la proteina ricombinante che ospita.

L'artemia ha ingerito la proteina capside ricombinante di Nodavirus espressa dai vari sistemi, che potrebbe essere confermato dall'immunoblotting.

La proteina capside ricombinante espressa dal diverso sistema è stata poi alimentata ad Artemia, che sono stati alimentati con larve di halibut atlantico a 100 dph. Dieci settimane dopo, i giovani in tutti i gruppi di trattamento sono stati sfidati da un i.p. iniezione (vedi figura 7) con Nodavirus per verificarne l'efficacia.

I pesci sfidati sono stati soppressi otto settimane dopo la sfida e testati per la presenza di Nodavirus nel cervello mediante RT-PCR in tempo reale mirata al segmento RNA2 virale. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i diversi gruppi di trattamento, compreso il gruppo con proteina ricombinante che ha mostrato protezione in precedenza.

Ciò indica che la dimensione del pesce e la necessità di selezionare il pesce per ridurre al minimo l'enorme variazione tra gli individui nelle diverse fasi al momento della vaccinazione hanno i suoi limiti intrinseci e dovrebbero essere considerati con attenzione.

In conclusione, sebbene sia stato dimostrato che l'Artemia assorbirà e accumulerà le varie forme di proteine ​​del capside di Nodavirus ricombinanti e agirà come vettore per la somministrazione orale alle larve di ippoglosso atlantico, gli esperimenti di sfida indicano che questa strategia di consegna dell'antigene non induce protezione contro l'infezione da Nodavirus, almeno nelle condizioni utilizzate in questo studio.

È stato prodotto un manuale tecnico di produzione per l'ippoglosso atlantico e può essere scaricato dal sito Web del progetto all'indirizzo www.diversifyfish.eu.

Questo progetto di 5 anni (2013-2018) ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro dell'Unione europea per la ricerca, sviluppo tecnologico e dimostrazione (KBBE-2013-07 single stage, GA 603121, DIVERSIFICARE).

Il consorzio comprende 38 partner provenienti da 12 paesi europei, tra cui nove PMI, due Grandi Imprese, cinque associazioni professionali e una ONG di consumatori- ed è stato coordinato dal Centro ellenico per la ricerca marina, Grecia.