dal dottor Karthik Masagounder, Responsabile Ricerca Acquatica e Suina, Evonik Nutrition and Care GmbH, Germania e il dottor D Allen Davis, Professoressa, Università di Auburn, Stati Uniti d'America

Uno studio in vitro basato sugli enzimi estratti dall'epatopancreas dei gamberetti ha mostrato che i gamberetti sono in grado di scindere completamente i quattro isomeri disponibili della DL-metionil-DL-metionina (AQUAVI® Met-Met) ma a velocità diverse. Ciò consente la liberazione e l'assorbimento ritardati di D- e L-Metionina (Met) nel tratto digestivo. Però, non sono stati pubblicati dati in vivo che mostrino cambiamenti nel profilo postprandiale di Met nell'emolinfa - un fluido analogo al sangue nei vertebrati - di gamberetti alimentati con diverse fonti di Met.

Abbiamo quindi avviato uno studio per indagare e confrontare i livelli di Met postprandiale in relazione ad altri aminoacidi nell'emolinfa di diete alimentate con gamberetti bianchi integrati con AQUAVI® Met-Met o DL-Met. Gli effetti di diverse fonti sui livelli di Met di emolinfa di gambero sono stati valutati con due frequenze di alimentazione (una al giorno e tre volte al giorno) per capire se la frequenza di alimentazione avrebbe influenzato gli effetti dietetici sui livelli di Met di emolinfa.

Met è in genere il primo amminoacido limitante nel pratico mangime per gamberetti e quindi la sua integrazione è essenziale. Studi precedenti hanno dimostrato che AQUAVI® Met-Met è una fonte Met più efficiente (≥ 200%) per i gamberetti rispetto a DL-Met (Xie et al. 2017; Niu et al. 2018). La migliore biodisponibilità di AQUAVI® Met-Met rispetto a DL-Met è attribuita principalmente a (i) la sua minore solubilità in acqua e lisciviazione e (ii) il rilascio lento e lungo di Met da diversi sterioisomeri (DL-Met-Met, LD-Met-Met, LL-Met-Met, DD-Met-Met).

Progettazione di prova per testare diverse fonti di metionina e frequenze di alimentazione

La dieta basale è stata formulata per contenere circa il 37% di proteine ​​utilizzando la farina di soia come fonte proteica primaria, e l'otto percento di lipidi e ~20 MJ/kg di energia lorda utilizzando grano e olio di pesce come principali fonti di energia. La dieta di base è stata formulata per soddisfare le note esigenze nutrizionali dei gamberi bianchi ad eccezione del Met. Sono state formulate due diete di prova sostituendo lo 0,30% di glicina dalla dieta di base con lo 0,30% di DL-Met (dieta DL-Met) o lo 0,31% di AQUAVI® Met-Met (dieta Met-Met).

Tutte le diete sono state pellettate a pressione utilizzando un tritacarne e uno stampo da 3 mm presso il laboratorio di alimentazione della Auburn University. Dopo la pellettizzazione, le diete sono state essiccate ad un contenuto di umidità dell'8-10 percento e conservate a 4°C. I livelli di Met e di altri aminoacidi analizzati nelle tre diete hanno mostrato valori simili a quelli pianificati.

Nella prova uno, 54 carri armati, ogni vasca contenente quattro gamberetti (~17 g di peso corporeo medio), erano abituati. Ogni dieta è stata offerta a 18 serbatoi (volume 80l) in totale. Ciò ha consentito di triplicare i campioni di emolinfa (un campione di emolinfa raccolto da quattro gamberetti per vasca) in ogni momento per sei punti temporali (0, 15, 30, 45, 60 e 120 min) per ogni gruppo dietetico (tre repliche x sei time point x tre diete =54 vasche). Nessun serbatoio è stato campionato più di una volta. I gamberetti sono stati precondizionati alle diete sperimentali ad un'alimentazione al giorno per quattro giorni prima del campionamento dell'emolinfa.

L'alimentazione per diversi serbatoi è stata scaglionata tra le 8 e le 10 del mattino per consentire il tempo per i campionamenti in diversi serbatoi nei momenti prefissati. Prima del giorno del prelievo, gamberetti sono stati a digiuno durante la notte e campioni di emolinfa basale sono stati prelevati da tre vasche in ciascun gruppo dietetico a zero minuti appena prima dell'alimentazione. Ai gamberetti nelle vasche rimanenti è stato offerto un eccesso delle rispettive diete sperimentali per 15 minuti, i serbatoi sono stati travasati per rimuovere l'eventuale mangime in eccesso, e gamberetti sono stati successivamente digiunati durante la raccolta dell'emolinfa.

Nella prova due, i gamberetti sono stati condizionati alle diete per quattro giorni prima della raccolta dell'emolinfa. Ogni dieta è stata offerta a 15 vasche (volume 80 l) contenenti quattro gamberetti (~ 21 g di peso corporeo medio) per vasca. La prima alimentazione per diversi serbatoi è stata sfalsata tra le 7:00 e le 9:30 per consentire i campionamenti di emolinfa il giorno del campionamento nei momenti prestabiliti. È stato dato un intervallo di tre ore tra i due pasti durante il giorno. Campioni di emolinfa da vasche triple di gamberetti sono stati pianificati dopo il terzo pasto fino a 60 minuti per ogni intervallo di 15 minuti.

Il quinto giorno, gamberetti a digiuno durante la notte sono stati nutriti due volte ciascuno della durata di un'ora, seguendo lo stesso schema alimentare utilizzato nei giorni precedenti. Dopo ogni poppata, i serbatoi sono stati travasati per qualsiasi mangime non consumato e i gamberetti sono stati tenuti a digiuno per due ore. Prima della terza poppata, campioni di emolinfa basale sono stati prelevati a zero minuti da tre vasche. Ai gamberetti nelle vasche rimanenti è stato offerto un eccesso delle rispettive diete per 15 minuti e successivamente sono stati a digiuno durante i campioni successivi. Campioni di emolinfa sono stati prelevati a 15 anni, 30, 45, e 60 minuti, ogni volta da tre vasche di gamberetti in ciascun gruppo di trattamento.

I campioni di emolinfa raccolti sono stati centrifugati e decantati per ottenere campioni di aminoacidi liberi. I campioni sono stati quindi liofilizzati e analizzati per il contenuto di singoli amminoacidi.

La quantità assoluta di Met e gli amminoacidi totali (TAA) sono stati valutati per ciascun trattamento dietetico e per ogni punto temporale. Al fine di eliminare l'influenza della variazione della quantità di mangime consumata dai singoli gamberetti sui livelli di Met in un dato momento, Il livello di Met è stato espresso in percentuale del TAA misurato. Questo valore è stato poi confrontato tra i trattamenti ei diversi momenti per le due diverse frequenze di alimentazione. I dati sono stati sottoposti ad ANOVA a due vie per misurare gli effetti delle diete e diversi punti temporali sui livelli di emolinfa TAA (μg/ml) e Met (μg/ml, (%TAA) di gamberetti. Inoltre, combinando entrambi i dati di prova, anche il livello di emolinfa Met (%TAA) è stato sottoposto ad ANOVA a tre vie per valutare gli effetti della dieta, tempo e frequenza di alimentazione (il punto temporale 120 min è stato escluso per l'alimentazione 1x).

Durante lo studio, la temperatura dell'acqua è stata mantenuta intorno ai 30°C. L'ossigeno disciolto è stato mantenuto vicino alla saturazione utilizzando pietre porose in ciascun acquario e il serbatoio di sump utilizzando una comune linea aerea collegata a un ventilatore rigenerativo. La salinità dell'acqua è stata mantenuta a circa nove ppt.

Impatti della dieta (fonti di metionina), tempo dopo l'alimentazione e frequenza di alimentazione nell'emolinfa

I risultati degli effetti principali e di interazione delle diete e del tempo sui livelli di amminoacidi emolinfatici dei gamberetti sono riassunti nella Tabella 2. Nello studio uno, dove i gamberi venivano nutriti una volta al giorno, la dieta influenzava solo i livelli di emolinfa Met (μg/ml, %TAA), ma non TAA. Entrambi i livelli di TAA e Met sono stati influenzati dal tempo. Però, nessun effetto di interazione dovuto alla dieta e al tempo è stato rilevato su TAA o Met. I livelli di emolinfa Met erano più alti nella dieta Met-Met alimentata con gamberetti rispetto alla dieta basale (μg/ml) o sia alla dieta basale che DL-Met (%TAA). Il livello di emolinfa Met espresso in %TAA ha mostrato livelli più elevati nell'emolinfa per la dieta DL-Met rispetto alla dieta di base. Attraverso le diete, Livelli di Met e TAA nell'emolinfa dei gamberetti misurati a 15, 30 e 45 minuti dopo l'alimentazione erano generalmente più alti di quelli misurati in altri momenti (0, 60 e 120 minuti).

Nella prova due, dove i gamberetti venivano nutriti tre volte al giorno, quantità assoluta di livelli di TAA e Met (μg/ml) nell'emolinfa dei gamberetti ha mostrato effetti di interazione dovuti alla dieta e al tempo (vedere la tabella 2). Però, non è stato possibile rilevare una tendenza particolare a causa dell'interazione dieta x tempo. Per di più, il confronto post-hoc con il tukey non ha mostrato differenze significative tra le combinazioni medie. Le variazioni nel tempo del picco dei livelli di aminoacidi all'interno dei gruppi dietetici erano probabilmente dovute alle differenze nell'assunzione di mangime tra gli individui. Il grado di sazietà tra gli individui sembra variare maggiormente quando i gamberetti vengono nutriti più spesso.

L'esame dei livelli di emolinfa Met come %TAA corregge parzialmente gli effetti confondenti delle variazioni nell'assunzione di mangime sugli effetti della dieta. I livelli di Met in %TAA hanno mostrato effetti dovuti alla dieta o al tempo senza alcuna interazione tra di loro. I livelli di Met (%TAA) erano più alti nella dieta Met-Met alimentata con gamberetti rispetto a quelli alimentati con la dieta di base, mentre la dieta DL-Met alimentata con gamberetti ha mostrato livelli intermedi di Met non significativi. I livelli di Met (%TAA) hanno raggiunto il picco a 15 minuti dopo l'alimentazione e poi sono diminuiti nel tempo. Effetti temporali simili sono stati osservati anche sui livelli di TAA e Met (μg/ml) quando esaminati in quantità assoluta.

L'analisi dei dati Met dell'emolinfa (%TAA) ottenuti da entrambi gli studi tramite un'ANOVA a tre vie ha mostrato effetti significativi dovuti alla dieta, tempo, e frequenza di alimentazione senza effetti di interazione. I gamberetti alimentati con la dieta Met-Met hanno mostrato livelli di emolinfa Met significativamente più alti rispetto a quelli alimentati con la dieta basale o DL-Met, mentre i gamberetti alimentati con la dieta DL-Met hanno mostrato livelli di Met più elevati rispetto a quelli alimentati con la dieta di base. Come rilevato in precedenza, Il livello di Met (%TAA) nell'emolinfa ha raggiunto il suo picco a 15 minuti dopo l'alimentazione ed era significativamente migliore di quello osservato a 0, 45 o 60 minuti dopo l'allattamento. L'alimentazione di gamberetti tre volte al giorno ha comportato un livello di Met più elevato nell'emolinfa rispetto a quelli alimentati una volta al giorno. L'analisi dei dati con ANOVA a tre vie mostra chiaramente un aumento dei livelli di emolinfa Met con la dieta Met-Met rispetto alla dieta basale o DL-Met sia nella frequenza di alimentazione.

Globale, i risultati dello studio dimostrano chiaramente che l'alimentazione con la dieta integrata AQUAVI® Met-Met rispetto alla dieta integrata con DL-Met determina un Met più alto (% TAA) nell'emolinfa dei gamberetti per lungo tempo. e con ciò, può supportare una maggiore sintesi proteica corporea e migliori prestazioni di crescita. Questo studio in vivo fornisce prove della maggiore efficienza biologica osservata negli studi precedenti per AQUAVI® Met-Met rispetto a DL-Met.