La proteinasi simile alla subtilisina (AprBp) di Bacillus pumilus 3-19 è un candidato promettente per l'uso industriale come additivo per mangimi. Però, per ottenere un'elevata resa dell'enzima, è necessario sviluppare un sistema di espressione altamente efficiente.

Lo scopo dello studio era ottenere un'espressione stabile del gene della proteasi B. pumilus 3-19 nel sistema di espressione di Pichia pastoris e valutare la correlazione dell'attività enzimatica con la scelta del tipo di vettore e dei peptidi segnale. In questo studio, per l'espressione stabile del gene della proteasi ottimizzato nelle cellule di lievito metilotrofiche, sono stati selezionati i vettori pPINK-HC e pPINK-LC. Per la secrezione extracellulare di proteasi ricombinante, è stata utilizzata una serie di peptidi segnale efficaci. La presenza del fattore α-accoppiamento ha ripetutamente portato ad un aumento della secrezione di proteine ​​ricombinanti. D'altra parte, le sequenze dei peptidi segnale killer e lisozima non sono state precedentemente utilizzate per l'espressione della proteasi batterica in P. pastoris.

Colonie di trasformanti con costrutti basati sul vettore pPINK-LC sono state rilevate il 3° giorno di incubazione e hanno mostrato un'efficienza di trasformazione maggiore rispetto alle colonie con costrutti basati sul vettore pPINK-HC, che sono stati rilevati solo il 7° giorno di incubazione. L'efficienza di trasformazione al decimo giorno di incubazione per le strutture basate sul vettore pPINK-LC era in media di 1,3×103 trasformanti/μg di DNA, mentre 1,03×103 trasformante/μg di DNA è stato registrato per i costrutti con il vettore pPINK-HC. Colony PCR ha mostrato che tutte le colonie trasformanti selezionate contenevano il gene della proteasi simile alla subtilisina integrato nel genoma del lievito.

Lo studio ha mostrato che il tempo di incubazione influisce sulla sintesi della proteasi in P. pastoris, ed è stata osservata la massima attività dell'enzima. I ceppi di lievito con costrutti basati sul vettore a bassa copia pPINK-LC hanno mostrato una maggiore attività proteasica (U/ml) nell'idrolisi dell'azocaseina (2,63 ± 0,16 per il peptide segnale killer (SP), 2,49 ± 0,08 per la presequenza del fattore di accoppiamento α, 2,19 ± 0,11 per lisozima SP) rispetto ai ceppi con costrutti basati sul vettore pPINK-HC (1,86 ± 0,09 per killer SP, 2,21 ± 0,07 per la presequenza del fattore di accoppiamento α, 1,31 ± 0,11 per lisozima SP), indipendentemente da quale peptide segnale è stato utilizzato. La massima attività proteasica è stata ottenuta per ceppi di lievito con costrutti pPINK-LC-killer-aprBp (5,75±0,08 U/ml) e pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33±0,07 U/ml).

Questo studio ha dimostrato che la proteasi simile alla subtilisina da ceppi ricombinanti di P. pastoris mostra attività proteolitica, che dipende dal tempo di incubazione e dalla scelta del peptide segnale e del vettore. La produzione di proteasi bacillare da parte del sistema di espressione eterologo a base di lievito rende questo sistema promettente per lo sviluppo di nuovi additivi per mangimi per la zootecnia.

Le proteasi sono classificate tra i tre maggiori gruppi di enzimi industriali e rappresentano circa il 60% della vendita globale totale di enzimi, Di cui il 40% appartiene a proteasi batteriche. Le serina proteasi batteriche hanno un'ampia specificità di substrato, ed elevata resistenza a varie condizioni, che ne garantisce l'uso in biotecnologia, in particolare come bioadditivi per uccelli e animali da cortile. Inoltre, l'integrazione dei mangimi con proteasi migliora l'assorbimento degli amminoacidi da parte degli animali e fa risparmiare fondi per l'acquisto di amminoacidi sintetici. È stato inoltre dimostrato che l'uso di proteasi come additivi per mangimi aumenta la biodisponibilità dell'azoto, che a sua volta riduce i livelli di inquinamento da ammoniaca nel suolo. Anche, le proteasi facilitano l'azione di altri enzimi e aumentano l'economicità dei mangimi, oltre a promuovere la crescita della microflora benefica nell'intestino dei polli da carne.

Oggi, in Russia viene utilizzato un numero limitato di proteasi commerciali di produttori stranieri. I principali rappresentanti sul mercato russo sono gli additivi per mangimi importati CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), STATI UNITI D'AMERICA), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Svizzera), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Germania). Il ricombinante ottenuto comprende ceppi di P. pastoris con gene della proteasi bacillare subtilisina-simile (aprBp) e tre diversi peptidi segnale (fattore di accoppiamento α, proteina killer e lisozima). L'ulteriore espressione e purificazione della proteasi dal liquido di coltura del lievito e lo studio delle sue proprietà biochimiche ed enzimatiche aiuteranno a valutare le prospettive biotecnologiche dell'enzima ricombinante.

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