Tecniche di coltura tissutale

Tecniche di coltura tissutale nelle piante, Procedura di prestito per l'allestimento della coltura tissutale e dello sviluppo della coltura tissutale.

Introduzione:

Che cos'è la coltura tissutale? La coltura tissutale è la coltivazione di una pianta durante l'uso di una talea o di altri tessuti vegetali. La coltura dei tessuti è la forma più comune di riproduzione e clonazione delle piante in serra. La coltura tissutale può essere utilizzata per riprodurre piante che dimostrano un'eccezionale resistenza alle malattie, o qualche altra caratteristica desiderata. Il tessuto coltivato può essere costituito da una singola cellula, una popolazione di cellule, e una parte di un organo. Le cellule in coltura possono moltiplicarsi; cambiare taglia, modulo, esibire attività specializzate; o interagire con altre cellule.

Le tecniche di coltura tissutale sono spesso utilizzate per la produzione commerciale di piante e per la ricerca sulle piante. La coltura tissutale prevede l'utilizzo di piccoli pezzi di tessuto vegetale, che vengono coltivate in un mezzo nutritivo in condizioni sterili. Utilizzando le condizioni di crescita adatte per ogni tipo di espianti, le piante possono essere indotte a creare rapidamente nuovi germogli, e, con l'aggiunta di ormoni adeguati nuove radici. Queste piantine possono essere divise, produrre un gran numero di nuove piantine. Le nuove piante possono quindi essere poste nel terreno e coltivate normalmente. Terreni di coltura tissutale , è un gruppo di sistemi utilizzati per coltivare cellule vegetali, tessuti o organi in condizioni sterili su un terreno di coltura nutriente di composizione nota. La coltura di tessuti vegetali è ampiamente utilizzata per generare cloni di una pianta in un metodo noto come micropropagazione.

Importanza della coltura tissutale:

• In un tempo e spazio relativamente brevi, si possono produrre un gran numero di piantine a partire dal singolo espiante.
• L'espianto generalmente non distrugge la pianta madre, piante così rare e in via di estinzione possono essere clonate in sicurezza.
• È facile selezionare i tratti desiderabili direttamente dalla configurazione della coltura (in vitro) diminuendo così la quantità di spazio necessaria, per prove sul campo.
• Una volta stabilito, una linea di coltura tissutale può fornire un approvvigionamento continuo di giovani piante durante tutto l'anno.
• Il tempo necessario è molto ridotto, non voglio aspettare l'intero ciclo di vita dello sviluppo del seme. Per le specie che hanno lunghi tempi di generazione, bassa fase di produzione del seme, o semi che prontamente non germogliano, è possibile una rapida propagazione.
• Piante che crescono in vitro generalmente libere, dalle malattie batteriche e fungine. Eradicazione del virus e mantenimento delle piante in uno stato esente da virus. Ciò facilita il progresso dell'impianto attraverso i confini internazionali.
• Le banche di colture di tessuti vegetali possono essere congelate e quindi rigenerate attraverso la coltura di tessuti. Conserva le collezioni di polline e cellule da cui le piante possono essere propagate.

Tipi di coltura tissutale:

Cultura del seme

La coltura dei semi è il tipo di coltura tissutale utilizzata principalmente per piante come le orchidee. Per questo metodo, gli espianti sono ottenuti da una pianta derivata in vitro e introdotti in un ambiente artificiale, dove arrivano a proliferare.

Cultura dell'embrione

La coltura di embrioni è il tipo di coltura tissutale che prevede l'isolamento di un embrione da un organismo noto per la crescita in vitro. La cultura dell'embrione può occupare l'uso di un embrione maturo o immaturo. Considerando che gli embrioni maturi in coltura sono ottenuti principalmente da semi maturi, comporta l'uso di embrioni immaturi da semi ibridi che non sono riusciti a germinare. Così facendo, l'embrione è infine in grado di creare una pianta vitale. Per la coltura dell'embrione, l'ovulo, il seme da cui si vuole ottenere l'embrione è sterilizzato, e l'embrione non deve essere sterilizzato di nuovo. Il saccarosio sale può essere usato per dare all'embrione sostanze nutritive. La coltura embrionale è arricchita con composti organici o inorganici, sali inorganici e regolatori di crescita.

Cultura del callo

La coltura del callo è formata dalla proliferazione del tessuto genitore. Le cellule di un callo sono parenchimatose, amorfo e disorganizzato. In genere, la cultura del callo si forma a seguito di una lesione alle estremità tagliate di uno stelo o di una radice. Un centro di attività localizzato è registrato in un callo.

Cultura degli organi:

Ciò può consentire la differenziazione e la conservazione dell'architettura. La cultura dell'organo si riferisce alla coltura in vitro e al mantenimento di un organo asportato primordiale o intero o parte di un organo nel modo e nella funzione.

Un'altra cultura

L'androgenesi è lo sviluppo in vitro di piante aploidi originate da potenti granuli di polline attraverso una serie di divisioni e differenziazioni cellulari.

Embriogenesi somatica

Questo è il processo di un singolo o gruppo di cellule che avvia il percorso di crescita che porta alla rigenerazione riproducibile di embrioni monozigoti in grado di germinare per formare piante complete.

Elaborazione di cellule e tessuti in coltura:

Le colture vive possono essere esaminate direttamente al microscopio, oppure possono essere osservati per mezzo di fotografie e filmati ripresi al microscopio. cellule, tessuti, e gli organi possono essere uccisi, fisso, e colorato per un ulteriore esame. Dopo la fissazione, i campioni possono essere incorporati e tagliati in sezioni sottili per rivelare ulteriori dettagli al microscopio ottico o elettronico.

Le cellule in colture di tessuti vegetali sono sottoposte a un'ampia gamma di trattamenti sperimentali. Per esempio, virus, droghe, vitamine, microrganismi patogeni possono essere aggiunti alla coltura. Gli scienziati poi osservano le cellule, cercando cambiamenti globali nel comportamento cellulare per cambiamenti in molecole specifiche, come alterazioni nell'espressione di una particolare proteina.

Approfondimenti biologici:

La coltura dei tessuti vegetali ha consentito numerose scoperte nelle scienze biologiche. ha rivelato, informazioni di base sulle cellule per quanto riguarda la loro composizione e forma; loro biochimica, genetico, e l'attività riproduttiva; e la loro alimentazione, metabolismo, funzioni specializzate. È anche processi di invecchiamento e guarigione; gli effetti sulle cellule del fisico, chimico, e agenti biologici; e le differenze tra cellule normali e cellule anormali, come le cellule cancerose. Il lavoro con le colture di tessuti vegetali ha aiutato a riconoscere le infezioni, e anomalie cromosomiche, per classificare i tumori, e per formulare e testare farmaci e vaccini.

Dalla scoperta che certi virus crescono nelle colture di tessuti, la tecnica è stata utilizzata per produrre vaccini contro la poliomielite, morbillo, parotite, e altre malattie infettive. Le colture cellulari hanno prodotto inibitori virali, compreso l'interferone. Gli ormoni sono prodotti da colture di cellule o organi. I globuli bianchi coltivati ​​da due individui possono essere utilizzati per determinare la compatibilità tra potenziali donatori e riceventi di trapianti di tessuto.

Fasi principali della coltura dei tessuti vegetali:

Fase di avvio:

La fase di iniziazione è la prima parte della coltura del tessuto vegetale. Qui, il tessuto di interesse viene ottenuto e sterilizzato al fine di evitare che qualsiasi microrganismo influisca negativamente sul processo. È durante questa fase che il tessuto viene avviato alla coltura.

Fase di moltiplicazione:

La fase di moltiplicazione è la seconda fase della coltura tissutale in cui il materiale vegetale in vitro viene suddiviso e quindi introdotto nel terreno. Qui, il terreno è composto da componenti appropriati per la crescita, compresi regolatori e nutrienti. Questi sono responsabili della proliferazione del tessuto e della creazione di più germogli.

Allungamento:

Le piante vengono trasferite di nuovo, nella cappa a flusso laminare, su un supporto che fa allungare i germogli. Questo è lo stadio in cui gli steli delle piante crescono in lunghezza e iniziano ad assomigliare a piccole piante.

Formazione delle radici:

È in questa fase che si formano le radici. Qui, gli ormoni sono necessari per indurre il radicamento, e di conseguenza piantine complete. Ciò può verificarsi nel lavoro di coltura tissutale in serra, a seconda della specie. I germogli allungati vengono tagliati dal tessuto di base e posti su supporti che contengono auxine, per il radicamento. Una volta che le radici sono visibili, le piante possono essere piantate nella serra. Le piante provenienti dall'ambiente di laboratorio sono cresciute ad alta umidità relativa sono molto tenere. Devono essere osservati molto da vicino quando vengono spostati nella serra per assicurarsi che si acclimatino correttamente.

Attrezzatura utilizzata per la coltura dei tessuti:

La propagazione mediante coltura tissutale necessita di un certo numero di apparecchiature di laboratorio. Le varie apparecchiature e le loro funzioni sono;

Autoclave: La sterilizzazione di tutti gli apparecchi in vetro e dei terreni di coltura può essere eseguita mediante vapore generato nell'autoclave.

Saldi analitici o Top Pan: Per una misurazione accurata dei diversi costituenti dei terreni di coltura, questi saldi sarebbero necessari. La bilancia a piatto superiore viene utilizzata per misurare quantità maggiori, mentre la bilancia analitica viene utilizzata per misurare quantità minori.

misuratore di acidita: Viene utilizzato per misurare e regolare la concentrazione di ioni idrogeno dei terreni di coltura o della soluzione. La concentrazione di ioni idrogeno vuole essere mantenuta con precisione per ottenere una crescita ottimale delle piante.

Armadi a flusso d'aria laminare: In questi armadi i germogli sviluppati sugli espianti vengono separati dai grappoli e trasferiti in un terreno fresco in condizioni sterili.

Set di distillazione: L'acqua da utilizzare per la preparazione dei terreni di coltura deve essere priva di impurità e sali.

Condizionatori d'aria con stabilizzatori: Mantenimento della temperatura preferita nella stanza di crescita, la stanza di inoculazione o la stanza di trasferimento della coltura sarebbe possibile con l'aria condizionata di queste aree.

Microscopi: a) Stereomicroscopio:ciò consentirebbe di sezionare il meristema di piccole dimensioni dalle punte dei germogli rimuovendo le coperture protettive dei primordi fogliari.

1. b) Microscopio composto:consente il rilevamento di batteri e funghi nelle colture e nei tessuti vegetali.

Unità di lavaggio delle bottiglie: Poiché un gran numero di bottiglie o recipienti in cui verranno sviluppate le piante devono essere lavati ripetutamente prima dell'uso, sarebbe utile un lavabottiglie automatico.

Vassoi: Struttura di supporto per bottiglie o recipienti di coltura.

Portelli: Passa attraverso le scatole utilizzate come passaggio tra l'area pulita e l'area semi-pulita per lo scambio di materiali.

Kit di dissezione: Questi sono necessari per la separazione dei germogli e la preparazione di micro talee.

Usi della coltura di tessuti vegetali:

La coltura di tessuti vegetali viene utilizzata per aumentare migliaia di piante geneticamente identiche da un'unica pianta madre chiamata cloni soma. Poiché questo processo di micropropagazione produce nuove piantine per decine di migliaia, è stato ampiamente utilizzato per la realizzazione di piante commercialmente importanti, comprese le piante alimentari come pomodoro , Banana , e Mela , ecc. Un esempio dell'applicazione della micropropagazione è stato osservato nella coltivazione delle orchidee in quanto è cresciuta in modo esponenziale a causa dell'accessibilità di milioni di piantine grazie ai metodi di coltura dei tessuti. Perché è importante la coltura dei tessuti vegetali? In questa cultura, il mezzo di crescita o la soluzione di coltura è molto importante in quanto viene utilizzato per aumentare il tessuto vegetale perché contiene vari nutrienti vegetali sotto forma di "gelatina" nota come agar e ormoni vegetali che sono necessari per la crescita delle piante.

Requisiti della coltura del tessuto vegetale:

Ambito e formazione della cultura del tessuto vegetale, si riferisce alla coltivazione in vitro di piante, semi e varie parti delle piante (organi, embrioni, tessuti, singole cellule, e protoplasti).

La coltura dei tessuti vegetali è una delle aree della biotecnologia in più rapida crescita a causa del suo alto potenziale per lo sviluppo di colture e piante ornamentali migliorate. Con i progressi fatti nella coltura tissutale, tecnologia, è ora possibile rigenerare specie di qualsiasi pianta in laboratorio. Per ottenere l'obiettivo di creare un nuovo impianto o un impianto con le caratteristiche desiderate, la coltura tissutale è spesso abbinata alla tecnologia del DNA ricombinante. Le tecniche di coltura dei tessuti vegetali hanno ampiamente aiutato nella rivoluzione verde migliorando la resa e la qualità delle colture. Le informazioni ottenute da colture di tessuti vegetali hanno contribuito alla nostra comprensione del metabolismo, crescita, differenziazione e morfogenesi delle cellule vegetali. A causa della vasta gamma di applicazioni, la coltura dei tessuti vegetali attira l'attenzione dei biologi molecolari, coltivatori e industriali di piante. Chi ha introdotto la coltura dei tessuti vegetali? Nel 19 ° secolo, è nata l'idea di sperimentare tessuti e organi di piante in condizioni controllate di laboratorio. Per la prima volta nel 1902, un fisiologo tedesco, Gottlieb Haberlandt, sviluppato la teoria della coltura cellulare in vitro.

In linea con la tecnologia e l'obiettivo della propagazione della coltura tissutale, possono essere richiesti vari servizi anche di seguito;

Terra: È necessario allestire un laboratorio, unità della pianta madre, serra e ufficio. Potrebbe essere necessario spazio per l'installazione di pozzi tubolari o scavati e per il parcheggio dei veicoli.

Piante madri: Le piante madri fornirebbero una fonte di tessuti. Le loro prestazioni devono essere testate prima dell'uso, come fonte di espianti. In caso di collegamento con laboratori consolidati, gli espianti dalle piante madri di prova possono essere disponibili gratuitamente. Altrimenti, collezione, sarebbe necessaria la manutenzione e la sperimentazione di piante madri superiori.

Laboratorio: Un laboratorio di coltura tissutale normalmente comprende una sala per la preparazione dei terreni, magazzino multimediale, stanza di inoculazione, sala di trasferimento culturale, zona lavaggio, ecc. La planimetria deve essere progettata per promuovere la massima efficienza. Il progetto deve facilitare il mantenimento della temperatura ottimale, umidità, illuminazione e ventilazione. La corretta progettazione di un laboratorio non solo ridurrà la contaminazione, ma otterrà un'elevata efficienza nelle prestazioni lavorative. I laboratori correttamente pianificati e progettati possono ridurre sia i costi operativi che quelli energetici.

Serra nella cultura dei tessuti: Nella propagazione della coltura tissutale, può essere necessaria una serra per allevare e mantenere le piante madri in modo che la crescita degli organi adatti alla coltura dei tessuti sia massima, in particolare nel caso di piante ornamentali, e per indurire regolarmente le piantine in un ambiente naturale. La serra consentirà il controllo dell'intensità della luce e dell'umidità, che è essenziale per l'indurimento delle piante.

Elettricità: Come risulterà evidente dai paragrafi precedenti, nessun laboratorio di coltura tissutale può funzionare senza elettricità. L'elettricità è essenziale per fornire l'intensità di luce richiesta ai tessuti e ai germogli in crescita mentre sono in laboratorio, per far funzionare varie attrezzature e strutture, che includono i condizionatori.

Acqua: Acqua per la coltivazione di piante madri, indurimento delle piantine, mensa, servizi igienici, ecc. L'acqua distillata è necessaria per la preparazione dei terreni di coltura e dei reagenti.

Materiali grezzi: Materie prime necessarie per il progetto di coltura tissutale, a parte l'espianto, sono diversi costituenti dei terreni di coltura.

Manodopera qualificata: La coltura di tessuti vegetali è un'operazione altamente qualificata. Sarebbe, perciò, essere necessario che i lavoratori di laboratorio e di serra siano ben qualificati ed esperti nella tecnologia. Sarebbe utile la loro formazione in laboratori commerciali consolidati.

Fasi di coltura dei tessuti vegetali:

Quali piante vengono coltivate per coltura tissutale? Le nuove piante possono quindi essere poste nel terreno e coltivate normalmente. Molti tipi di piante sono appropriati per l'uso in classe. Cavolfiore , talee di rosa, Le foglie di violetta africana e gli steli di garofano produrranno facilmente cloni attraverso la coltura dei tessuti.

Preparazione del mezzo nutritivo

Si prepara un mezzo semisolido in acqua bidistillata contenente macroelementi, microelementi, aminoacidi, vitamine, fonte di ferro, fonte di carbonio come saccarosio e fitormoni. Il terreno viene riscaldato per sciogliere l'agar e vengono dispensati da 25 ml a 50 ml in ciascuna bottiglia a bocca larga. I recipienti contenenti i terreni di coltura vengono quindi sigillati e sterilizzati in autoclave.

Istituzione di coltura asettica

Il materiale di partenza per la procedura è generalmente una punta di germoglio in crescita attiva di gemma ausiliaria o terminale o punta di germoglio di una pianta. La procedura di coltura dei tessuti vegetali parte dalla selezione di piante madri aventi le caratteristiche desiderate.

Se possibile ex-pianta si isola il tessuto meristematico della pianta madre selezionata. Il tessuto/espianto asportato viene lavato con acqua e quindi risciacquato con un disinfettante come una soluzione di savlon o Dettol seguito da un lavaggio con acqua sterile. Il tessuto viene quindi immerso in una soluzione di candeggina al 10% per dieci minuti per disinfettare il materiale del tessuto vegetale, uccidendo la maggior parte degli organismi fungini e batterici. La procedura di sterilizzazione degli espianti dipende dalle specie vegetali e dai tipi di espianti

Inoculazione

Il processo di inoculazione viene effettuato in condizioni asettiche. In questa procedura espianti o microgermogli vengono trasferiti sul mezzo nutritivo sterilizzato.

Sviluppo delle piante nella stanza di crescita

Dopo l'inoculazione del tessuto vegetale, le bottiglie vengono sigillate e trasferite nella stanza di crescita per innescare un processo di sviluppo sotto luce diffusa a 23-27°C e 50-60% di umidità relativa. I requisiti di luce e temperatura variano da specie a specie e talvolta durante le varie fasi di sviluppo.

Le colture vengono osservate quotidianamente per la crescita e qualsiasi segno di infezione o contaminazione. Culture, che non mostrano una crescita eccellente o infetti, vengono scartati. Le colture sane si sviluppano in piccoli germogli. Questi sono subcoltivati ​​sul terreno fresco dopo quattro settimane. Il numero di subcolture necessarie è specifico della specie vegetale, che sono standardizzati. I germogli si sviluppano generalmente dopo quattro settimane. Dopo aver sviluppato un numero sufficiente di germogli in ciascun contenitore, ad un'altezza minima di 2 cm vengono trasferiti su altro terreno per iniziare la procedura di radicazione. Il costituente dello standard di radicazione per ogni specie di pianta è specifico. Le radici si formano generalmente entro due o quattro settimane. Le piante in questa fase sono delicate e richiedono un'attenta manipolazione.

Indurimento di micro piante

A causa dell'elevata umidità all'interno del recipiente di coltura e delle condizioni di sviluppo artificiali, le piantine sono tenere e quindi non sono pronte per far fronte alle condizioni del campo. Le piante rimosse dal terreno sterile vengono lavate e mantenute sotto nebbia intermittente o coperte con plastica trasparente pulita. Dopo 10-15 giorni in condizioni di elevata umidità, le piante vengono trasferite in serra e mantenute per altre 4-6 settimane. Sono quindi completi per essere trasferiti in una nuova casa o in un campo. Normalmente, le piante di coltura di tessuti vegetali sono vendute come piante ex-agar o piante indurite dalla serra.

La procedura di coltura del tessuto vegetale:

Le parti della pianta utilizzate per la coltura sono chiamate espianti. Gli espianti vengono coltivati ​​in vitro su un mezzo nutritivo che si rivolge a completare le sue esigenze nutrizionali. Il mezzo nutritivo deve dare quanto segue:-

1. Macronutrienti – Questo include elementi come l'azoto (N), fosforo (P), potassio (K), calcio (Ca), zolfo (S) necessario per una corretta crescita e morfogenesi.
2. Micronutrienti – Elementi come il ferro (Fe), manganese (Mn), zinco (Zn), eccetera., fondamentale per la crescita dei tessuti.
3. Fonte di carbonio o energia – Questo è uno dei principali ingredienti cruciali dei mezzi nutritivi. Il saccarosio è la fonte di carbonio ampiamente utilizzata tra gli altri carboidrati.
4. Vitamine, aminoacidi, e altri sali inorganici.

I terreni di coltura servono anche come mezzo per fornire regolatori di crescita delle piante ai problemi che determinano la loro morfogenesi secondo il requisito. I tessuti degli espianti perdono prima la loro specificità per formare un duro nodulo marrone chiamato callo. Il callo quindi si divide per aumentare un organo vegetale o un'intera pianta nuova a seconda della quantità e della composizione dei fitormoni forniti. L'intera procedura richiede il mantenimento di condizioni asettiche rigorose in ogni momento poiché una singola contaminazione può rovinare un intero lotto di piante. Perché la coltura tissutale si chiama micropropagazione in vitro? La coltura tissutale è un metodo di propagazione utilizzato per generare piante in condizioni sterili. Si chiama micropropagazione in vitro, perché, gli espianti sono coltivati ​​su terreno e le risorse genetiche sono conservate sotto forma di. Le piante micropropagate sono esenti da virus e mostrano una maggiore produttività e resa.

Vantaggi della coltura del tessuto vegetale:

Moltiplicazione di massa di cloni d'élite: La micropropagazione consente la creazione di un gran numero di piante da piccoli pezzi della pianta madre. La produzione richiede tempi moderatamente brevi per la crescita delle piante. A seconda della specie in produzione, un ex-impianto può essere moltiplicato in diverse migliaia di piante in meno di un anno.

Miglioramento della pianta attraverso la coltura dei tessuti: Creation of superior varieties of agricultural crops is possible through plant tissue culture method, which otherwise is not possible during conventional plant breeding methods.

True to Type production: a Large number of true to the type plants can be propagated within a short time and space and that too throughout the year. Per esempio, it may be possible to propagate 2 to 4 lakhs of tissue cultured plants from a single bush or rose against 10 to 15 plants by conventional means. Anche, it may take about 2 to 4 months to produce a healthy planting material by tissue culture means, whereas a minimum of 6 to 8 months is required for most species by the latest method of plant propagation.

Higher yields: Tissue Culture Plants may have increased branching &flowering, greater vigor and higher yield, mostly due to the possibility of elimination of diseases.

Beneficial when conventional propagation is difficult: The process may succeed to propagate plants where seeds or conventional propagation is not possible or undesirable.

Flexible method: The flexibility of nurseries can be better. As the capital investment on the mother plant is reduced to almost zero, it can be easier to adapt to changing conditions.

The innovation of new varieties: Plant tissue culture can be utilized for breeding new varieties.

Financial assistance in Tissue culture:

The tissue-culture export-oriented developments are eligible for refinance support by NABARD. Banks can provide loans for the activity provided the scheme is technically feasible &financially viable.

Bank Loan:

A bank loan of 75 to 80 % of the total cost of development shall be available from the financing institution. Bank loan considered in the model is 75%.

The rate of interest:

Banks are free to choose the rate of interest within the overall RBI guidelines issued from time to time. Però, the final lending rate has been considered as 12% for working out the bankability of the model project.