di Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Blue Aqua International Group of Companies, Tailandia

L'acquacoltura dei gamberetti è stata drammaticamente colpita da molte malattie patogene, causata principalmente da V. parahaemolyticus e dal virus della sindrome delle macchie bianche (WSSV). Lo scopo di questo studio era di valutare il potenziale utilizzo di due additivi funzionali per mangimi di AlphaGuard*L Plus (liquido) e AlphaGuard*P (polvere) composti da oli essenziali (eucalipto, timo, origano appartenenti rispettivamente alla famiglia delle Myrtaceae e delle Lamiaceae), Trigliceridi a catena media (MCT) e composti bioattivi naturali nei gamberetti contro i patogeni causati da malattie, in particolare V. parahaemolyticus e WSSV.

I risultati hanno indicato che AlphaGuard*L Plus ha ritardato efficacemente la progressione della malattia nei gamberetti. Questi risultati suggeriscono che l'additivo per mangimi funzionale di AlphaGuard*P e AlphaGuard*LPLUS potrebbe essere utilizzato per promuovere la difesa dei gamberetti contro gli agenti patogeni.

introduzione

La pratica dell'intensificazione dell'acquacoltura è ostacolata dalla salute e dalla nutrizione che influiscono sulle prestazioni di crescita. Per districare queste conseguenze, additivi funzionali per mangimi sono stati utilizzati per stimolare il sistema immunitario dei gamberetti e migliorare le prestazioni dei gamberetti, specialmente per controllare i patogeni virali e batterici nel recente trattamento di malattie dei gamberetti come V. parahaemolyticus che ha causato la malattia da necrosi epatopancreatica acuta (AHPND) e il virus della sindrome del punto bianco (WSSV) che ha causato la macchia bianca Malattia (WSD), combinato con l'attuazione di misure di biosicurezza.

La composizione di AlphaGuard che compone MCT e olio essenziale viene riconosciuta come pratica GRAS. In questo studio, l'efficienza del prodotto AlphaGuard è stata ottenuta combinando i dati dei risultati dei test di diffusione del disco, sfide della malattia e istologia, insieme a una valutazione degli effetti del prodotto AlphaGuard sulle malattie dei gamberetti.

Materiali e metodi

Batteri e virus patogeni
Due patogeni virulenti nei gamberetti, V. parahaemolyticus e V. harveyi in stock di glicerolo, sono state sottocoltivate in Tryptic Soy Broth (TSB) + un percento di NaCl, incubato a 37oC per 24 ore, prima strisciato su agar tiosolfato-citrato-sali biliari-saccarosio per ottenere la sua coltura pura.

La sospensione di WSSV è stata preparata dal muscolo di gamberi infettati da WSSV. Brevemente, il muscolo di gambero contenente WSSV è stato rimosso dalla conservazione a -80°C e tagliato in pezzi uniformi in condizioni sterili a freddo, quindi omogeneizzato in tampone TN (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) a 0,1 g/ml.

Dopo la centrifugazione a 2, 000 rpm per 10 minuti a 4°C, il surnatante è stato diluito a 1:100 con 0,9% di NaCl e filtrato a 0,45 micron. Il surnatante risultante è stato conservato a -80°C, fino a quando non è stato utilizzato come fonte di iniezione di WSSV per gli esperimenti di sfida.

L'attività antimicrobica

Test di diffusione del disco
5 µl di AlphaGuard*L Plus e AlphaGuard*P, concentrazione che va da 0, 0,25, 0,5, 1,0 e 10 percento di diluizione con NaCl 0,85 percento, sono stati assorbiti in cinque millimetri di diametro, Dischi di carta spessi 0,9 mm quindi asciugati all'aria prima di essere inseriti in 105 cellule di coltura batterica in una capsula di Petri di 100 x 15 mm di larghezza. Come controllo negativo è stata utilizzata una soluzione di NaCl allo 0,85%. Sono state utilizzate tre piastre replicate per ciascun trattamento e le osservazioni sono state registrate dopo 24 ore.

Infezione artificiale da V. parahaemolyticus e determinazione del numero di Vibrio nell'emolinfa del gambero (HL) e nell'epatopancreas (HP)

V. parahaemolyticus è stato riattivato dalla conservazione a -80°C e coltivato in TSB + 1% di NaCl a 37°C durante la notte. La coltura è stata centrifugata a 5, 000 giri/min per 10 minuti, per rimuovere il surnatante, e il pellet è stato risospeso in NaCl sterile allo 0,85% ad una densità di 8,4 × 106 CFU/ml.

Il gamberetto, alla quinta settimana, sono stati infettati iniettando 100 μL della sospensione batterica nel secondo segmento addominale di gamberetti sani alla quinta settimana di coltura e la mortalità è stata registrata per sette giorni.

I gamberetti sono stati raccolti casualmente il terzo giorno dopo l'infezione per ogni trattamento e lavati tre volte con acqua sterile. HL è stato prelevato dalla cavità pericardica utilizzando una siringa sterile monouso da un mL in condizioni sterili e aggiunto a un volume uguale di anticoagulante sterile (aggiungendo 10 mM EDTA-Na2 a 450 mMNaCl, 10 mMKCl, HEPE da 10 mm, pH 7.3, 850 mOsm.kg-1 o 10 mM Tris-HCl, 250 mM di saccarosio, Citrato di sodio 100 mM, pH 7,6).

L'HL e l'HP macinato sono stati diluiti in serie 10 volte con PBS sterile freddo. Ogni diluizione è stata distribuita su piastre di agar TCBS poste capovolte in un incubatore a 37°C e coltivate per 16-20 ore. Sono state contate piastre contenenti 30-300 colonie batteriche, quindi i numeri sono stati registrati come CFU/ml o CFU/g.

Infezione artificiale con WSSV

ml del filtrato sono stati iniettati per via intramuscolare in gamberi sani alla quinta settimana di coltura. I gamberetti sono stati raccolti in modo casuale sei ore dopo l'infezione per l'esame istopatologico e la mortalità f è stata registrata per sette giorni.

Condizioni di crescita dei gamberetti e gruppi sperimentali

I gamberi sono stati acquistati da allevamenti tailandesi locali. Sono risultati negativi per V. parahaemolyticus-causato AHNPD e WSSV mediante analisi PCR. Dopo essersi acclimatato per una settimana in un acquario, prima dell'esperimento, gamberetti apparentemente sani con lunghezza del corpo uniforme sono stati divisi casualmente in tre gruppi con sei repliche per gruppo, 20 gamberi per replica.

La capacità dell'acquario era di 100 litri, contenente 60 litri di acqua di mare. La proprietà dell'acqua salina è stata mantenuta a 15 ppt, pH 7,7-8,0 e DO>4,0 mg/L. Ogni trattamento contiene giovani gamberetti con un peso medio iniziale di 2,6 g stoccati casualmente in ogni vasca.

I gamberi sono stati nutriti a sazietà fino a circa il 2,5-3 percento del loro peso corporeo, tre volte al giorno per cinque settimane. L'alimentazione è stata regolata giornalmente, in base alla loro velocità ingerita, per assicurarsi che il mangime fosse completamente consumato. Prima di nutrirsi, mute, feci, e i gamberi morti furono rimossi, Il 20 percento dell'acqua in ciascun serbatoio veniva scambiato ogni tre giorni con nuova acqua di mare.

Diete sperimentali e raccolta dati

Tutti i gruppi sono stati mantenuti, durante l'esperimento, nelle stesse condizioni di acclimatazione. Il gruppo di controllo è stato alimentato con pellet di gamberetti commerciali, rivestito con l'1% di chitina-chitosano. I gruppi di trattamento sono stati alimentati con AlphaGuard*L Plus spruzzato o con AlphaGuard*P, mescolato con pellet di gamberetti commerciali e ricoperto dall'1% di chitina-chitosano, al dosaggio 5,0 ml o g/Kg mangime. I parametri di mortalità e qualità dell'acqua sono stati registrati giornalmente. Al termine del processo, è stato valutato il tasso di sopravvivenza.

analisi statistica

Unità sperimentali di analisi statistica, carri armati, e gli acquari sono stati distribuiti in modo completamente casuale. I dati quantitativi sono stati controllati per la normalità e l'omoschedasticità. I dati sono stati analizzati utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) per cercare differenze significative (p <0,05) tra le medie di trattamento.

Risultati

L'attività antibatterica mediante metodi di diffusione del disco e l'inclusione nella dieta dei gamberetti sulla resistenza alle malattie di AlphaGuard*L Plus o AlphaGuard*P

Test di diffusione del disco

Le concentrazioni di AlphaGuard*L Plus e AlphaGuard*P di almeno l'uno percento inibiscono sia V. harveyi che V. parahaemolyticus, però, c'era una maggiore efficacia di inibizione per V. parahaemolyticus rispetto a V. harveyi. La concentrazione effettiva di AlphaGuard avrebbe potuto essere ridotta se l'avessimo diluita in liposolubili, come l'etanolo, per il test.

Composizioni di oli essenziali, le tecniche di dosaggio e la modalità di azione sono state riviste in modo approfondito. Questo studio non ha indagato nei dettagli molecolari per i suoi meccanismi, però, l'effetto principale delle proprietà battericide potrebbe essere correlato alla loro interferenza sull'integrità e la permeabilità della membrana come composto lipofilo da olio essenziale e MCT.

Diversi acidi grassi negli MCT hanno una diversa concentrazione minima inibitoria (MIC), a seconda del tipo di acido grasso, microrganismo, e pH ambientale. L'aspetto sinergico e antagonistico tra gli ingredienti in AlphaGuard non è chiarito in questo studio. L'olio essenziale di AlphaGuard agisce anche come antiossidante per prevenire o rallentare l'ossidazione degli MCT insaturi per prolungarne la durata oltre all'antistress nei gamberetti.

V. parahaemolyticus challenge test

Al termine dell'esperimento di prova del mangime, gamberetti sono stati sfidati da V. parahaemolyticus. È stato tracciato il tasso di mortalità cumulativo (vedi figura due). I risultati del tasso di mortalità, dopo il challenge di V. parahaemolyticus per un intervallo di sette giorni, hanno mostrato che i gruppi di gamberetti nutriti con AlphaGuard*P e AlphaGuard*L Plus avevano tassi di mortalità significativamente inferiori rispetto al gruppo di controllo dopo il quarto giorno di infezione.

Sia AlphaGuard*P che AlphaGuard*L Plus hanno avuto lo stesso tasso di mortalità statistica dopo il quinto giorno di infezione. Alla fine dell'esperimento, in contrasto, il tasso di sopravvivenza non era statisticamente correlato al tasso di mortalità per AlphaGuard*P, (vedi figura tre).

La capacità di eliminare i gamberetti da Vibrio spp. dopo tre giorni di infezione è stato tracciato, (vedi figura quattro). I risultati hanno indicato che il Vibriospp. il conteggio nell'emolinfa dei gamberetti alimentati da AlphaGuard*P e AlphaGuard*LPlus era inferiore rispetto ai gruppi controllati. La capacità dei gamberetti di difendersi dai batteri in HP, alimentato da AlphaGuard*LPlus, aveva anche una capacità di difesa molto migliore rispetto ai gamberetti non nutriti con AlphaGuard.

Prova di sfida WSSV

Il test di provocazione WSSV è stato condotto dopo cinque settimane dalla prova di alimentazione. La mortalità cumulativa è stata tracciata, (vedi figura cinque). Il gruppo di gamberetti nutriti da AlphaGuard*L Plus ha mostrato un significativo ritardo nella mortalità, rispetto ai gruppi di controllo e AlphaGuard*P-fedshrimp durante il loro secondo, terzo e quarto giorno, (vedi figura sei).

Questo è coinciso con nessun segno istopatologico di colorazione H&E infezione del tessuto WSSV nell'area di iniezione, tranne la generalizzazione della necrosi muscolare che è probabilmente correlata al meccanismo di difesa dei gamberetti dopo tre giorni dall'infezione. Tuttavia, tutti i gruppi hanno finito per avere una mortalità del 100%.

Conclusione

I risultati di questo studio hanno suggerito che l'applicazione dell'additivo per mangimi AlphaGuard*P e AlphaGuard*L Plus allo 0,5% con mangimi commerciali ha dimostrato l'efficacia nel promuovere la difesa dei gamberetti contro i patogeni. AlphaGuard*L Plus ha mostrato in particolare prestazioni migliori.